Sistema de siembra de células rotativas esféricas para la producción de pequeños

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3001 (2023) Citar este artículo

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Los vasos sanguíneos totalmente biológicos obtenidos mediante ingeniería tisular (TEBV) se desarrollaron previamente para uso clínico. Los modelos diseñados con tejidos también han demostrado ser herramientas valiosas en la modelización de enfermedades. Además, existe la necesidad de TEBV de geometría compleja para el estudio de patologías vasculares multifactoriales, como los aneurismas intracraneales. El objetivo principal del trabajo presentado en este artículo fue producir un TEBV de pequeño calibre, ramificado y totalmente humano. El uso de un novedoso sistema de siembra de células rotatorias esféricas permite una siembra de células dinámica eficaz y uniforme para un modelo viable de ingeniería de tejidos in vitro. En este informe, se describe el diseño y fabricación de un innovador sistema de siembra con rotación esférica aleatoria de 360°. Dentro del sistema se colocan cámaras de siembra hechas a medida y contienen andamios de tereftalato de polietileno glicol (PETG) en forma de Y. Las condiciones de siembra, como la concentración celular, la velocidad de siembra y el tiempo de incubación, se optimizaron mediante el recuento de células adheridas a los andamios de PETG. Este método de siembra esférica se comparó con otros enfoques, como la siembra dinámica y estática, y muestra claramente una distribución celular uniforme en andamios de PETG. Con este sistema esférico fácil de usar, también se produjeron construcciones TEBV ramificadas completamente biológicas mediante la siembra de fibroblastos humanos directamente en mandriles PETG de geometría compleja hechos a medida. La producción de TEBV de pequeño calibre derivados del paciente con geometría compleja y distribución celular optimizada a lo largo de la reconstrucción vascular puede ser una forma innovadora de modelar diversas enfermedades vasculares, como los aneurismas intracraneales.

El avance de los injertos vasculares diseñados mediante ingeniería tisular en los últimos años presenta una opción clínica prometedora para el tratamiento de enfermedades vasculares o para proporcionar modelos in vitro alternativos para estudiar estos trastornos complejos1,2. A través del refinamiento del modelo, ahora es posible producir vasos sanguíneos obtenidos mediante ingeniería tisular (TEBV) derivados de pacientes con antecedentes genéticos definidos para comprender mejor la patobiología detrás de las enfermedades vasculares3,4. A lo largo de los años se han desarrollado diferentes técnicas para generar TEBV, cada una de las cuales presenta sus ventajas y desventajas, y pueden clasificarse en tres categorías principales: (1) conductos vasculares hechos de células sembradas en andamios fabricados, (2) conductos vasculares hechos con láminas de células ingeniería y (3) bioimpresión5,6. Sin embargo, uno de los desafíos en la ingeniería de tejidos vasculares sigue siendo mejorar la siembra, distribución y organización celular para incorporar células de manera homogénea en una estructura tubular. En consecuencia, las técnicas de siembra de células dinámicas se han establecido sobre enfoques estáticos más simples7,8,9. Además, en un entorno tridimensional (3D), se necesita una distribución celular monitoreada uniformemente para fomentar una remodelación tisular homogénea y evitar la competencia por los nutrientes en áreas con mayor densidad celular10,11,12,13. El estado actual de la siembra celular dinámica permite una producción fácil de TEBV lineal con el uso de frascos enrollables y la siembra perfundida de células endoteliales en una construcción tubular. Sin embargo, estos no son ideales para la producción de TEBV de tres capas de geometría más compleja compuesta por una adventicia, una media y una túnica íntima4,14,15,16.

Anteriormente, se ha demostrado que la producción de vasos sanguíneos lineales de pequeño calibre autoensamblados sembrados en tereftalato de polietileno (PETG) pretratado con rayos ultravioleta-C (UV-C) garantiza una unión celular adecuada y una secreción optimizada de la matriz extracelular (MEC). asamblea14. Para producir TEBV con geometría compleja y mejorar la siembra de células a lo largo de los andamios, desarrollamos un sistema giratorio con un movimiento de rotación aleatorio que permite una distribución celular efectiva y uniforme. Describimos aquí el diseño y la fabricación de un innovador sistema de siembra rotatorio capaz de realizar una rotación completa de 360° y producir adventicia vascular de ingeniería tisular ramificada completamente biológica (TEBV-A).

Las especificaciones iniciales para la concepción de este novedoso sistema de siembra rotativa fueron una rotación de 360° con velocidad ajustable, un tiempo de operación de al menos 24 h y una capacidad de producción de un máximo de cinco TEBV simultáneamente. El diseño se hizo para que fuera simple, directo y fácil de usar (Fig. 1A). Este modelo incluye una esfera acrílica hecha de dos mitades puestas en un movimiento de rotación esférico mediante dos motores en una placa de soporte para que se puedan producir TEBV dentro de las cámaras de siembra sostenidas en el medio de la esfera (Fig. 1B-E). Este sistema de siembra ha sido adaptado para tener una rotación aleatoria de 360°. La rotación se considera aleatoria porque la velocidad constante de los motores se utiliza durante todo el tiempo de siembra y las imperfecciones en la forma de la esfera provocan cambios en el eje de movimiento (Video complementario 1). El sistema también tiene una velocidad ajustable de 63 a 135°/minuto, un tiempo de operación de más de 24 h y una capacidad de producción de cinco TEBV (Fig. 1F). También se puede colocar en un ambiente con una temperatura controlable durante la etapa de siembra.

Sistema de siembra rotativo. (A) Diseño asistido por computadora (CAD) del sistema con software CREO 5.0 con indicadores direccionales; (B,C) fotografías de las mitades masculina y femenina de la esfera acrílica con anillo de cierre impreso en 3D y placas para mantener las cámaras de siembra en su lugar; (D) placa soporte de aluminio con tres soportes tipo rodamiento de bolas, dos motores y una unidad de control electrónico; (E) cinco cámaras de siembra de células acrílicas hechas a medida; (F) sistema de siembra rotativo ensamblado. Barra de escala = 5 cm.

Se diseñaron cámaras de siembra hechas a medida para sembrar células de fibroblastos humanos en andamios de PETG ramificados (Fig. 2). Las cámaras están compuestas por dos mitades de policarbonato con muescas en forma de Y mecanizadas a medida adecuadas para albergar andamios de PETG en forma de Y de 4,8 mm de diámetro (Fig. 2A-C). Estos andamios están hechos de tres partes separadas unidas por pasadores de acero inoxidable para que las diferentes ramas se puedan quitar y desmontar fácilmente. La mitad inferior tiene una junta tórica en forma de Y, para hacer que la cámara sea hermética y la mitad superior tiene tres pequeñas aberturas que permiten agregar células y medios de cultivo (Fig. 2A). Las dos mitades se mantienen unidas con herrajes de acero inoxidable. Todas las piezas utilizadas para las cámaras pueden esterilizarse en autoclave y luego usarse bajo una campana biológica utilizando una técnica aséptica para sembrar células humanas (Fig. 2D). Es necesario colocar cinco de las cámaras de siembra cerradas dentro del sistema giratorio para que la esfera pueda funcionar correctamente (Fig. 2E).

Cámaras de siembra ramificadas hechas a medida. (A) CAD del sistema con software CREO 5.0 de la mitad inferior de la cámara de siembra acrílica con sangría en forma de Y y junta tórica en forma de Y; (B) CAD de andamio PETG personalizado en forma de Y con pasadores de acero inoxidable; (C) CAD de la cámara de siembra completa cerrada con hardware y vista de pequeños tornillos para los puertos de siembra; (D) fotografía de todas las piezas y hardware de las cámaras de siembra dentro de la campana biológica en un campo estéril; (E) fotografía de la cámara completa cerrada con hardware y vista de pequeños tornillos para el puerto de siembra. Barra de escala = 1 cm.

Para determinar los parámetros óptimos de siembra de células, primero probamos diferentes concentraciones celulares. Se utilizaron tres concentraciones celulares iniciales, indicadas aquí en millones de células por mililitro de medio de cultivo (M/mL), (0,1 M/mL, 0,15 M/mL y 0,30 M/mL) para sembrar las cámaras. Se permitió que las células se adhirieran a un mandril de PETG de 4,8 mm de diámetro durante un período de 22 h a una velocidad media de 90°/min. Luego se incubaron mandriles sembrados de células con tripsina durante 10 minutos y se contaron las células desprendidas. Se encontró que una concentración celular de 0,15 M/mL era el mejor parámetro de siembra celular (0,15 M/mL en comparación con 0,1 M, P <0,0010; 0,15 M/mL en comparación con 0,3 M/mL, P = 0,3805) (Fig. 3A ). No se observó ninguna diferencia significativa entre las condiciones para el número de células en el sobrenadante después de la siembra (Fig. 3A). Utilizando esta concentración celular óptima, quisimos determinar la mejor velocidad de siembra, es decir, la velocidad óptima para configurar el sistema giratorio esférico que permita que la mayor cantidad de células se adhieran al andamio. Se probaron tres velocidades de siembra diferentes (63°/min, 90°/min y 135°/min). Se encontró que el número de células adheridas al andamio de PETG era significativamente mayor cuando se usaba la velocidad de siembra de rango medio de 90°/min (63°/min en comparación con 90°/min; P = 0,0321, y 90°/min en comparación con 135° /min; P = 0,0119) (Fig. 3B). No se observó ninguna diferencia significativa en el número de células en el sobrenadante después de la siembra celular (Fig. 3B). También se probaron diferentes tiempos de incubación después de la siembra celular dentro de las cámaras (4 h, 8 h, 16 h y 22 h). Se descubrió que un tiempo de incubación de 22 h era el mejor parámetro en este caso, ya que se adhirieron más células al andamio con respecto a cualquier otro tiempo de incubación probado (P <0,0001). Además, se contaron más células en el sobrenadante después de 4 h de siembra en comparación con cualquier otro momento (P <0,0001), lo que indica que las células no tuvieron tiempo de adherirse adecuadamente al soporte y todavía estaban en el medio de cultivo (Fig. 3C). ). En general, los parámetros óptimos de siembra de células fueron células de 0,15 M/ml a una velocidad de 90 °/min durante 22 h a 37 °C.

Número de células adheridas a los soportes y al sobrenadante dependiendo de la concentración celular, la velocidad del sistema de siembra y el tiempo de incubación. (A) Se evaluaron tres concentraciones celulares en millones de células por mililitro de medio (M/mL) sembrando células a 90°/minuto durante 22 h; (B) se evaluaron tres velocidades del sistema (°/min) sembrando células 0,15 M/ml durante 22 h; (C) Se analizaron cuatro tiempos de incubación (horas) sembrando 0,15 M/ml a 90°/min. Para los análisis estadísticos se realizó un ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey. La gráfica (A – C) muestra el cuadro y los bigotes con máximo y mínimo. norte = 4–5/grupo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. ns no significativo.

La novedosa técnica de siembra esférica se comparó con un método de siembra dinámico y estático. En primer lugar, se puede observar la distribución celular en los armazones de PETG después de la siembra con una tinción con azul rodanilo (Fig. 4A). Se pueden observar distribuciones celulares aparentemente uniformes en los mandriles utilizando la técnica esférica en comparación con otras técnicas de siembra (Fig. 4A y Fig. 1 complementaria). Además, no se midió ninguna diferencia estadísticamente significativa entre la siembra esférica y las otras técnicas después de los recuentos adecuados de células adheridas a los andamios después del período de siembra de 22 h (Fig. 4B). Sorprendentemente, el TEBV-A, producido usando el sistema esférico descrito, fue estadísticamente mejor que el TEBV-A producido usando otras técnicas de siembra después de un período de maduración de 42 días de cultivo después de la siembra inicial (P <0,05 y P <0,0001) (Fig. 4C,D), lo que indica que una distribución uniforme puede ser importante para la producción de TEBV-A más espeso.

Distribución celular y viabilidad en TEBV-A post-sembrado y madurado producido mediante diferentes técnicas de siembra. (A) Fotografía de células teñidas con azul rodanilo en un andamio de PETG después de la siembra. Barra de escala = 1 cm; (B) número de células adheridas al andamio después de un período de siembra de 22 h; (C) Espesores del tejido TEBV-A (μm) medidos después de un período de maduración de 42 días; (D) Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones histológicas recolectadas de TEBV-A maduro producido utilizando diferentes técnicas de siembra (esféricas, dinámicas y estáticas). Barra de escala = 100 µm; (E,F) Ensayo vivo/muerto en células recolectadas de TEBV-A post-sembradas analizadas mediante citometría de flujo; (G,H) Ensayo vivo/muerto en células cosechadas de TEBV-A maduras. (B,C) Caja y bigotes con máximo y mínimo. Para los análisis estadísticos se realizó la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. norte = 4–24. (F,H) Barras apiladas con desviación estándar. Para los análisis estadísticos se realizó un ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey. n = 5. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. ns no significativo.

Otro aspecto importante a considerar aquí y comparar entre diferentes métodos de siembra es la viabilidad celular. Por lo tanto, se utilizaron ensayos de citometría de flujo vivo/muerto para cuantificar la viabilidad celular después de los períodos de siembra de 22 h (post-siembra) y de maduración de 42 días. Se encontró que la viabilidad posterior a la siembra era significativamente mayor cuando se utilizaba el sistema de siembra esférico en comparación con otros métodos de siembra; dinámico (P <0,001) y estático (P <0,001) (Fig. 4E, F y Fig. complementaria 2A). Aunque considerablemente menor, no se midió ninguna diferencia en la viabilidad celular después del período de maduración de 42 días después de la siembra en cualquiera de las técnicas de siembra probadas (Fig. 4G, H y Fig. Suplementaria 2B). La menor viabilidad celular medida en TEBV-A maduro podría explicarse simplemente aquí por la digestión enzimática de 30 minutos necesaria para recolectar las células de la ECM para el análisis de citometría de flujo; Este paso no es necesario en el período posterior a la siembra. En general, se midió una distribución celular más uniforme, un TEBV-A más grueso y una viabilidad celular mejorada utilizando el sistema giratorio esférico desarrollado en comparación con otras técnicas de siembra dinámicas y estáticas.

Se produjeron TEBV-A ramificados completamente biológicos, elaborados con fibroblastos humanos, utilizando los parámetros de siembra celular óptimos predeterminados. Después de un período de incubación de siembra celular de 22 h, las cámaras de siembra se desmontaron del sistema. Luego, los armazones sembrados con células se colocaron en placas de cultivo y se mantuvieron en cultivo durante 42 días. El espesor del tejido se midió utilizando un micrómetro láser en cada rama (Fig. 5A). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para las tres ramas de los TEBV, lo que indica una distribución celular uniforme a lo largo de los mandriles sembrados (Fig. 5A, B). Para producir TEBV con geometría compleja, como andamios en forma de Y, era crucial diseñar un sistema de siembra de células que permitiera una distribución celular uniforme a lo largo de los andamios y particularmente en el sitio de unión o ramificación. Todos los TEBV-A ramificados mostraron macroscópicamente células distribuidas uniformemente en el sitio de unión crítica (Fig. 5C, D). Además, se midieron los espesores del tejido a partir de secciones transversales histológicas de las ramas y las uniones (Fig. 5E, F) y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 5G).

Caracterización macroscópica y microscópica del TEBV-A ramificado producido con el sistema de siembra rotativa desarrollado. (A) Fotografía de un TEBV-A de geometría "Y" en un andamio de PETG ramificado; (B) espesor del tejido de las tres ramas (I, II, III) de TEBV-A en µm. norte = 4, norte = 4; (C) fotografía en primer plano de la unión TEBV-A en el andamio (D) y cortada del andamio; (E) Tinción H&E de la rama y (F) unión de la muestra TEBV-A cortada del andamio; (G) Espesor del tejido de las secciones histológicas de las ramas y la unión de TEBV-A en µm. n = 12. Las flechas muestran el sitio de unión. Para los análisis estadísticos se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn para el gráfico (B) y una prueba t de Welch para el gráfico (G). El gráfico (B,G) muestra el diagrama de dispersión con barras y desviación estándar. Barra de escala = 100 µm. ns no significativo.

En este artículo, logramos diseñar y construir un sistema de siembra de células esféricas giratorias capaz de producir TEBV biológicos de pequeño calibre con geometría compleja, compuestos íntegramente de células humanas. Los parámetros de siembra celular se optimizaron para mejorar la distribución celular y la adherencia a lo largo de las áreas del andamio, incluso en el punto crítico de ramificación/unión de los TEBV en forma de "Y" de prueba de concepto diseñados. En comparación con otros enfoques de siembra dinámica y estática, nuestro novedoso método de siembra esférica permite que las células se distribuyan de manera más uniforme a lo largo del TEBV producido, demostró una mayor viabilidad celular posterior a la siembra y produjo tejidos más gruesos. El sistema descrito incluía cámaras de siembra mecanizadas a medida y fácilmente esterilizables que contenían andamios de PETG tratados con UV-C diseñados para caber dentro de las cámaras de siembra. Cabe destacar que las cámaras de siembra se pueden rediseñar fácilmente con otras geometrías/especificaciones para ajustarse a diferentes formas, tamaños y ángulos de vasos sanguíneos en la bifurcación.

Se encontró que una concentración celular de 0,15 M/mL durante la siembra inicial de las cámaras, combinada con una rotación aleatoria en todas las direcciones (x, y, z) durante 22 h a una velocidad de 90°/min, eran los parámetros de siembra óptimos. para favorecer la adherencia y distribución celular a lo largo del andamio de PETG. Después del período de incubación de 22 h dentro de las cámaras de siembra, los armazones sembrados con células se retiraron de las cámaras y se cultivaron durante 42 días en medio de cultivo para promover la producción de ECM, el ensamblaje y la maduración de los TEBV. La cinética de las interacciones entre células y soportes sólidos siguió el modelo de Langmuir, para el cual se adaptaron sus tres supuestos al cultivo celular: (i) las células no pueden unirse para formar más que una monocapa; (ii) las células pueden adherirse a todas las superficies del andamio; (iii) las células pueden adherirse al andamio independientemente de las células ya adheridas hasta alcanzar una monocapa17,18. Se sabe que el tratamiento UV-C del PETG promueve la adherencia celular modificando los grupos carbonilo del plástico, lo que a su vez aumenta las propiedades hidrofílicas del material14,19,20,21. De acuerdo con la teoría de Langmuir, el movimiento rotacional del sistema de siembra dinámico descrito facilita las interacciones célula-andamio en toda la superficie del mandril de plástico tratado, lo que permitió una mejor adherencia y distribución celular7,8,22. De hecho, el movimiento aleatorio de 360° de este novedoso sistema permitió que las células encontraran todas las partes del complejo andamio de geometría durante el período de siembra. Esto quedó indicado por los espesores uniformes del tejido medidos a lo largo de las ramas del TEBV en forma de "Y". La tercera suposición de Langmuir implica que una vez que se alcanza una monocapa, las células dejan de unirse independientemente al andamio y comienzan a interactuar con otras células adheridas. Este aumento en las interacciones célula-célula a lo largo del tiempo puede haber promovido que las células se separaran del andamio y explicar por qué se recuperaron igual o menos células del PETG con una mayor densidad celular, alcanzando efectivamente una meseta17,21.

La velocidad media del sistema se consideró óptima para la siembra de células a 90°/min. Si bien todas las velocidades probadas fueron relativamente bajas, el sistema debía ser lo suficientemente rápido como para mantener las células suspendidas en el medio durante toda la siembra, pero lo suficientemente lento como para que las células interactuaran adecuadamente y se adhirieran al plástico. También se requirió un período de siembra más largo de 22 h para aumentar la unión celular. También se ha demostrado que velocidades lentas durante períodos de tiempo más prolongados promueven una mejor unión celular en otros modelos23,24. Los parámetros de siembra celular, como la velocidad, la densidad celular y el tiempo, dependen del tipo celular (interacción célula-estructura, adherencia celular, capacidad de producción de matriz), por lo que deben optimizarse para cada modelo de ingeniería tisular y tipo de célula que se va a sembrar9. ,25,26,27,28. Estimamos la velocidad de sedimentación (V) dentro de las cámaras de siembra de 2,5 µm/s para la población de fibroblastos analizada, utilizando la Ley de Stokes en mecánica de fluidos V = (g(ρp − ρf)d2)/18μ calculada utilizando las siguientes constantes: ( gravedad (g: 9,81 m/s2), densidad celular (ρp: 1050 kg/m3), densidad del medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (ρf: 1007 kg/m3), diámetro de las células de fibroblastos (d: 10 µm) y viscosidad DMEM (μ: 0,00093 Pa s) 29, 30. Aunque lenta, esta velocidad de sedimentación de los fibroblastos combinada con el movimiento de rotación aleatorio de la esfera durante 22 h permite una distribución celular uniforme en el andamio dentro de las cámaras de siembra giratorias, a pesar de la complejidad de la geometría 30 ,31.

El uso de motores de escobillas, para hacer girar la esfera en una rotación aleatoria de 360° a baja velocidad, está asociado a algunas limitaciones al haber alcanzado el máximo de su capacidad. La actualización a servomotores permitiría una rotación más precisa y al mismo tiempo eliminaría el riesgo de que los motores se detuvieran por sí solos debido al sobrecalentamiento, el aumento de la resistencia y la disminución del voltaje. Este sistema de siembra de células rotativas utiliza un potenciómetro para regular el voltaje de los motores y dictar la velocidad de rotación. La adición de un sistema de microcontrolador y una pantalla electrónica permitiría un mejor ajuste del voltaje y una velocidad de rotación más precisa durante la siembra celular.

En comparación con otras técnicas de siembra, el método del sistema de siembra esférico desarrollado permitió una distribución celular uniforme en armazones de PETG, así como producir TEBV-A maduro más espeso después de 42 días de cultivo celular, independientemente del número de células adheridas inicialmente a los armazones durante el período de siembra. . Una distribución celular más uniforme puede ayudar a la maduración del tejido y, en consecuencia, mejorar la secreción y el ensamblaje de la MEC32,33,34. Se ha demostrado que las interacciones célula-célula y célula-MEC en la ingeniería de tejidos son necesarias en el modelado de enfermedades para representar mejor la interferencia entre las células, las composiciones de los tejidos y el microambiente asociado a patologías humanas complejas11,35,36.

Aunque el modelo TEBV completo incorpora una adventicia (fibroblastos), media (células de músculo liso) y túnica íntima (células endoteliales), el estado actual de los modelos TEBV ramificados está evolucionando rápidamente desde prótesis vasculares ramificadas hasta stents vasculares ramificados en la clínica y tubos de colágeno ramificados. con células endoteliales y con injertos vasculares ramificados impresos en 3D4,37,38,39. Hasta donde sabemos, somos el primer equipo de investigación en producir un modelo TEBV ramificado de pequeño calibre totalmente biológico de la adventicia sin material exógeno. De particular interés es que el sitio de unión crítico permaneció intacto y no se rompió después del desmontaje del andamio. Este innovador sistema permite producir tejidos con el espesor suficiente para permitir su manipulación, observación y estudio con una sola lámina de fibroblastos monocapa, aunque aún no puede perfundirse. La siembra de células secuenciales múltiples podría ser el siguiente paso apropiado para producir TEBV multicapa más gruesos40.

La producción de TEBV de pequeño calibre derivados de pacientes con geometría compleja puede ser una forma innovadora de modelar diversas enfermedades vasculares. Por ejemplo, los TEBV construidos en forma de Y serían un modelo in vitro único para estudiar los aneurismas intracraneales (IA), que ocurren principalmente en las bifurcaciones del círculo de Willis en los individuos afectados41,42. La IA es un trastorno cerebrovascular en el que la debilidad de la pared de los vasos sanguíneos cerebrales provoca una distensión localizada43. Los IA presentan una tasa de mortalidad del 50% y una tasa de morbilidad del 30-50% en los supervivientes, tras su rotura44. El uso de TEBV en forma de Y cultivados en un biorreactor que permita generar un flujo sanguíneo artificial pero fisiológico será de particular interés en el estudio de la IA y la hemodinámica. Dado que el componente genético de los IA aún no se comprende muy bien, los TEBV multicapa y ramificados derivados de pacientes para producir vasos sanguíneos completamente reconstituidos con íntima, media y adventicia también serían de gran interés para el estudio de los mecanismos patogénicos y fisiopatológicos asociados a los IA.

En conclusión, presentamos un innovador sistema de siembra de células rotativas, fácil de usar, lavable y esterilizable, que permite producir cinco TEBV tubulares de pequeño calibre de la adventicia con una geometría compleja. En general, el sistema de siembra y las cámaras fueron conceptualizados y hechos a medida para que fueran de operación simple. Por lo tanto, el sistema descrito tendrá un impacto considerable para futuras investigaciones, considerando que las células distribuidas uniformemente a lo largo de los andamios durante la siembra celular son cruciales para el cultivo 3D y la ingeniería de tejidos.

Se utilizó el software CREO 5.0 (PTC, Boston, MA, EE. UU.) para producir CAD para el sistema de siembra antes de la construcción (Fig. 1A). La esfera se hizo a partir de dos mitades de una esfera hueca acrílica de 10 pulgadas de diámetro (California Quality Plastics, Ontario, CA, EE. UU.) (Fig. 1B, C). Se fabricaron dos anillos de cierre impresos en 3D con filamento PETG de 1,75 mm (Filaments.ca, Mississauga, ON, Canadá), se imprimieron en una impresora 3D H800 (Afinia, Chanhassen, Min, EE. UU.) y se pegaron a las mitades de la esfera con material médico Silastic™. elastómero de calidad (Dupont, Wilmington, NC, EE. UU.). Los anillos de cierre se mantienen unidos mediante tornillos de cabeza hexagonal de acero inoxidable (McMaster-Carr, Chicago, IL, EE. UU.) atornillados en el anillo de PETG macho y bloqueados en el anillo de PETG hembra. Se conceptualizaron e imprimieron placas impresas en 3D como se describió anteriormente para mantener en su lugar las cámaras de siembra. Las placas se fijaron a la esfera con soportes impresos en 3D que se pegaron al centro de la mitad de la esfera con Silastic™. Para garantizar que las cámaras de siembra permanezcan en su lugar mientras el sistema gira, se agregó presión mediante resortes de acero inoxidable resistentes a la corrosión (McMaster-Carr). La placa de soporte se fabricó con una aleación de aluminio 6061-T6 (Acier Picard, Levis, QC, Canadá) utilizando una fresadora de 3 ejes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, EE. UU.) (Fig. 1d). Se colocaron dos motores de escobillas de CC de 12 V, 10 RPM (RobotShop, Mirabel, QC, Canadá) perpendicularmente entre sí para proporcionar el movimiento de rotación del sistema. Se fabricaron a medida y se fijaron a la placa dos soportes de motor y tres soportes tipo rodamiento de bolas de aluminio. Se colocaron bolas de acero inoxidable resistentes a la corrosión dentro de los cojinetes de soporte para garantizar la rotación adecuada de la esfera y ofrecer soporte adicional (McMaster-Carr). Los componentes electrónicos para suministrar corriente y controlar la velocidad se colocaron dentro de una caja de PETG impresa en 3D. Los motores se conectaron a interruptores separados de 3 posiciones, un potenciómetro de 25 k, un regulador de voltaje lineal (Digi-Key, Thief River Falls, Min, EE. UU.) y una fuente de alimentación de 5 V CA/CC de grado médico (Newark, Mississauga, ON, Canadá). ) que se conecta a un tomacorriente de pared normal de 125 V. Todas las fotografías y videos se tomaron con la mini cámara del iPhone 12 (Apple, Cupertino, CA, EE. UU.).

También se utilizó el software CREO 5.0 (PTC) para producir CAD para las cámaras de siembra (Fig. 2A-C). Las cámaras constaban de dos mitades distintas de policarbonato hechas a medida (Groupe PolyAlto, Quebec, QC, CA). Se cortaron muescas en forma de Y en ambas mitades usando la fresadora de tres ejes (Fryer Machine Systems). La mitad inferior estaba rodeada por una junta tórica de silicona blanda para alta temperatura en forma de Y, de 3/32 de ancho fraccional (McMaster-Carr) para sellar las mitades de la cámara de siembra entre sí (Fig. 2D). La mitad superior se hizo con tres aberturas que sirven como puertos de siembra sellados con juntas tóricas de silicona blanda para alta temperatura, ancho fraccional de 3/64 y tornillos de fijación de punta cónica de acero inoxidable 18-8, rosca M4 × 0,7 mm, 4 mm de largo (McMaster-Carr). Los andamios desmontables en forma de Y se cortaron a medida con una fresadora de 5 ejes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, EE. UU.) a partir de varillas de PETG de 4,8 mm de diámetro (McMaster-Carr) y se mantuvieron unidos mediante clavijas de acero inoxidable 18-8. pasadores, 1/32" de diámetro, 1/4" de largo (McMaster-Carr). Estos andamios se colocan en el centro de las cámaras de siembra, dentro de la muesca en forma de Y, y las dos mitades se unen y se cierran completamente usando tornillos de cabeza hexagonal de acero inoxidable 316, rosca M4 × 0,7 mm, 16 mm de largo con Arandelas de acero inoxidable 316 de uso general para tornillo M4 Tamaño, 4.300 mm de diámetro interior, 8 mm de diámetro exterior y tuercas hexagonales de acero inoxidable 316, súper resistentes a la corrosión, rosca M4 × 0,7 mm (McMaster-Carr) (Fig. 2E). Todas las fotografías fueron tomadas con la mini cámara del iPhone 12 (Apple).

Se aislaron fibroblastos dérmicos humanos como se describió anteriormente45 y se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; VWR, Radnor, PA, EE. UU.), 100 UI/mL de penicilina G y 25 μg/mL. gentamicina (Sigma-Aldrich, Kawasaki, OL, Japón). El uso de células humanas fue aprobado por la junta de investigación ética del CHU de Quebec (número de protocolo: 1115C y 1115D) y el individuo fue reclutado de forma voluntaria tras el consentimiento informado. Las células se sembraron con 10 ml de medio de cultivo DMEM en las cámaras que contenían varillas de PETG tratadas con UV-C de 4,8 mm de diámetro (McMaster-Carr). Las cámaras de siembra se colocaron en el sistema de siembra rotatorio y se mantuvieron a 37 °C para experimentos posteriores. El tratamiento UV-C se realizó como se describió anteriormente durante 30 minutos por lado (giro de 90°) y luego se recubrió con gelatina al 0,2 % (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.)14. Para determinar la concentración celular óptima para usar durante la siembra inicial, se probaron tres condiciones (0,10, 0,15 y 0,30 M/mL) y se agregaron a las cámaras celulares, luego se colocaron en el sistema rotatorio a velocidad media durante 22 h. También se probaron tres velocidades de rotación diferentes para optimizar mejor los parámetros de siembra de células. Las cámaras se sembraron con fibroblastos (0,15 M/mL), se instalaron en la esfera giratoria durante 22 h a una velocidad de rotación de 63°, 90° o 135°/minuto, estas velocidades se consideraron las velocidades mínima, mediana y máxima alcanzables. por la esfera. También se probaron diferentes períodos de incubación después de la siembra celular. Las cámaras de siembra se sembraron con fibroblastos (0,15 M/mL), colocados en la esfera a una velocidad de rotación de 90°/minuto durante 4, 8, 16 y 22 h.

Los sobrenadantes se recuperaron y se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos al final de cada uno de estos tiempos de incubación. Las células restantes no adheridas y centrifugadas presentes en los sobrenadantes se resuspendieron en 1 ml de medio DMEM y se contaron utilizando un contador celular (Beckman Coulter, Pasadena, CA, EE. UU.). Primero se incubaron varillas de PETG con células sembradas o andamios en forma de Y con tripsina al 0,05% (Fisher Scientific)/EDTA al 0,01% (Teknisciences, Terrebonne, QC, Canadá) durante 10 minutos para permitir que las células se desprendieran y luego se centrifugaron a 300 xg. durante 10 min. Las células recuperadas se resuspendieron en 1 ml de medio y luego se contaron mediante un contador de células Coulter (Beckman Coulter).

Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos en medio DMEM con FBS al 10% y el cóctel de antibióticos. Se sembraron células de 0,15 M/ml en cámaras de siembra hechas a medida a través de los orificios de siembra. Se inyectaron un total de 10 ml de medio de cultivo DMEM en las cámaras de siembra que contenían andamios en forma de Y fabricados con varillas de PETG de 4,8 mm de diámetro (McMaster-Carr). Los andamios de PETG se trataron previamente con UV-C y luego se recubrieron con gelatina al 0,2 % (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) como se describió anteriormente14. Para la siembra esférica, las cámaras sembradas se colocaron en la esfera a 90°/minuto durante 22 h en una habitación a 37 °C. Para la siembra dinámica, las cámaras sembradas se colocaron en un agitador orbital (BlotBoy, Benchmark Scientific, Sayreville, Nueva Jersey, EE. UU.) durante 22 h en una incubadora a 37 °C y 8 % de CO2. Para la siembra estática, las cámaras se colocaron directamente en una incubadora de CO2 al 8% a 37 °C durante el período de siembra de 22 h. Luego se recuperaron los soportes sembrados con células y se colocaron en una placa de cultivo celular de 500 cm2 que contenía medio de cultivo DMEM, suplementado con 50 μg/ml de ácido ascórbico (Sigma), durante 42 días en una incubadora a 37 °C y 8 % de CO2. El medio se cambió cada 2 a 3 días y los soportes se giraron 180° cada día de cambio de medio de cultivo.

Se tomaron imágenes macroscópicas de andamios de PETG en forma de Y sembrados de células con la mini cámara del iPhone 12 (Apple). Los espesores de los tejidos en las tres ramas diferentes del andamio en forma de Y se midieron con un micrómetro láser de alta precisión (Keyence, Mississauga, ON, Canadá). Para el análisis estadístico se utilizaron cuatro mediciones diferentes en cada una de las ramas de cuatro TEBV diferentes en forma de Y. Los TEBV se fijaron en formalina al 3,7% durante la noche (ChapTec, Montreal, QC, Canadá). También se tomaron fotografías macroscópicas de los sitios de unión de los TEBV biopsiados antes del análisis histológico. Luego se tiñeron secciones transversales fijas de TEBV de 10 μm con hematoxilina y eosina (H&E) como se describió anteriormente36. Las imágenes microscópicas se adquirieron y midieron en condiciones de campo brillante utilizando un microscopio vertical (AxioImager.M2; Carl Zeiss Microscopy, Jena, TH, Alemania). Para el análisis de distribución, los andamios sembrados se fijaron en formalina al 3,7% durante 30 minutos, luego se colocaron en tinción con azul rodanilo durante 15 minutos, luego se enjuagaron antes de dejar secar antes de tomar fotografías macroscópicas de todos los lados del andamio.

Después de los períodos de siembra de 22 h, los sobrenadantes se recuperaron y se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos para cada técnica de siembra. Se incubaron varillas de PETG sembradas con células con tripsina al 0,05% (Fisher Scientific)/EDTA al 0,01% (Teknisciences) durante 10 minutos para permitir que las células se desprendieran y luego se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos. Las células recuperadas del sobrenadante y los armazones se incubaron durante 15 minutos con Calceína AM 2,5 nM (Thermo-Fisher) para marcar células vivas y Ethidium homodimer-1 4 μM (Thermo-Fisher) para marcar células muertas. Las células se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo BD FACSMelody™ (BD Biosciences) y los datos se trataron utilizando el software FlowJo™ v9 (Ashland, OR, EE. UU.). Para los tejidos maduros, primero se recuperaron de los soportes y se colocaron en una solución de digestión de 5,7 U/ml de colagenasa H (Sigma-Aldrich) en accutasa (Sigma-Aldrich) a 37 °C con agitación de 300 rpm durante 30 min. Las células se filtraron a través de un filtro celular de 40 µm (Fisher Scientific) y se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos. Finalmente, las células se analizaron como se describe a continuación.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.). Los datos presentados en gráficos de caja y bigotes con máximo y mínimo se analizaron mediante ANOVA de dos factores con la prueba de comparación múltiple de Tukey o mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos presentados en un diagrama de dispersión con media y desviación estándar (DE) se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn o mediante la prueba t de Welch. Los datos presentados por barras apiladas con SD fueron analizados mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Un valor de P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El estudio fue aprobado por nuestros Comités de Ética Institucionales (Junta de Investigación Ética del CHU de Québec; protocolo número 1115 C y 1115 D. Para obtener más información, comuníquese con ([email protected]). Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las Directrices de políticas nacionales de los Tres Consejos: Conducta ética para investigaciones con seres humanos y aprobadas por el comité de ética del CHU de Quebec—Université Laval.

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados de forma voluntaria en el estudio.

Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Nos gustaría agradecer a Marc-André Campagna, André Chamberland, Patrick Dupuis, Frédéric Morin y Pierre Carrier del taller de ingeniería mecánica de la Universidad Laval. Nos gustaría agradecer a Todd Galbraith, Vincent Clement, Isabella Bienjonetti y Richard Brodeur por su asistencia técnica y valiosos consejos.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fondo de Investigación de Nuevas Fronteras (NFRF) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). JR es beneficiario del NFRF. FG-L. ha recibido cátedras de investigación de Canadá. VR ha recibido una beca de doctorado del Fonds de la Recherche du Quebec en Santé (FRQS).

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes y François Gros-Louis

División de Medicina Regenerativa, Centro de Investigación CHU de Quebec, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes, François Gros-Louis y Jean Ruel

Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alexandre Winter y Jean Ruel

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Conceptualización, AB, AW, VR, FG-L. y JR; metodología, AB, AW, VR, LT-D., FG-L. y J.R.; software, AB y AW; validación, VR, FG-L. y J.R.; análisis formal, AB y VR; investigación, AB, AW y LT-D.; recursos, LT-D., FG-L. y J.R.; curación de datos, AB y AW; redacción: preparación del borrador original, AB; Escritura: revisión y edición, AB, AW, VR, FG-L. y J.R.; visualización, AB y VR; supervisión, VR, FG-L. y J.R.; administración de proyectos, FG-L. y J.R.; adquisición de financiación, FG-L. y JR Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Jean Ruel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Brodeur, A., Winter, A., Roy, V. et al. Sistema de siembra de células rotatorias esféricas para la producción de vasos sanguíneos de tejido de pequeño calibre con geometría compleja. Representante científico 13, 3001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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Recibido: 08 de septiembre de 2022

Aceptado: 10 de febrero de 2023

Publicado: 21 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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